CAR-T细胞免疫基因疗法治疗HIV/AIDS面临的挑战及策略

HIV是人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus)的缩写，它通过破坏抵抗疾病和感染的重要免疫细胞削弱一个人的免疫系统。使用嵌合抗原受体改造的T细胞（CAR T）以加强T细胞对表达HIV病毒的细胞的靶向和杀伤能力,是目前一种强有力的HIV治疗方法。与天然的效应T细胞（CTL）相比，CAR T可以阻止或限制病毒的免疫逃逸，因为它们直接识别抗原，而不依赖于MHC的递呈。并且，CAR T细胞在体外生成后，可以在体外或在病人体内扩大几个数量级，这就提供了大量的抗原特异性细胞。理想情况下，CAR T细胞可以稳定并持久地监视贮藏的HIV病毒。

· CAR T细胞治疗简介

       嵌合抗原受体（CAR）包含三个结构域：一个细胞外结构域用于特异性结合抗原，一个跨膜部分用于固定受体，以及一个胞内结构域用于传递信号。其中，胞外结构域是一个来源于抗体或受体的可变区的单链片段变体（scFv）。胞内结构域通常是CD3ζ，是T细胞抗原受体的信号传导部分。利用这些特征，研究人员可以设计CAR来识别特定的抗原，并激活表达CAR的效应细胞。在临床实践中，研究人员可以从病人的血液中分离T细胞，建构CAR T细胞并进行扩增，然后再回输给病人。以HIV特异性CAR T治疗为例：先从HIV患者身上收集CD8+T细胞，再转入CAR基因；在体外验证了抗HIV的特异性和有效性后，将有功能的抗HIV特异性CAR T细胞重新注入病人体内，以杀死HIV感染的细胞。

· CAR T的发展历程 

       最早的关于抗HIV CAR的研究是将CD4胞外结构域（主要的HIV的细胞受体）与CD3ζ信号结构域融合（CD4ζ）。选择CD4作为 抗HIV CAR设计的优势在于，作为天然的HIV包膜识别分子，CD4确保了广泛的靶向性。此外，CD4在包膜蛋白上的结合位点是相对保守的。多项临床试验对该第一代基于CD4的CAR T细胞疗法在HIV患者中的效率和安全性进行了测试。试验表明，这种治疗并不能持久地控制病毒的复制；然而，这种治疗没有明显的毒性，而且改造后的T细胞可以在体内存活10年以上。缺乏病毒控制的原因可能有：（1）基于CD4的CAR使T细胞更易受HIV病毒感染，（2）缺乏共刺激信号，（3)T细胞扩增能力不理想，（4）缺乏病毒抗原的刺激。

       第二代CAR是在含有CD3ζ的第一代CAR的胞内尾部加入共刺激分子的结构域，如CD28或4-1BB。优化的包含了4-1BB结构域的抗HIV的第二代CAR-T细胞，其在体外抑制HIV复制的效力与只表达第一代CARs的T细胞相比至少高出50倍。动物研究表明，第二代CAR-T细胞与没有共刺激分子的CAR-T相比，在遇到抗原时能更快进行扩增，保护CD4+T细胞不受HIV感染。此外，类似的研究表明，4-1BB共刺激结构域在减少ART治疗后的病毒反弹和增加T细胞在没有抗原的情况下在体内的存在时间方面优于CD28结构域。

       第三代CAR是在第二代CAR中加入多种共刺激分子。第三代CAR T细胞已被开发出来，并且具有更强的效应功能、增殖和存活能力，最终增强对肿瘤的杀伤力。第三代抗gp120的CAR分子结合了多个细胞内信号域（CD3ζ-CD28-41BB），与CD4ζ-CAR相比，在体外裂解表达Env的细胞时显示出更大的效力。

      第四代CAR T细胞，又称为T细胞重定向为产生通用细胞因子介导的杀伤力 (TRUCKs)，含有第三种刺激信号，可产生细胞因子，如IL-7、IL12、IL-15或IL-18，旨在改善CAR T细胞的扩增能力和延长其在体内的存在时间，目前正在研究其对实体肿瘤的靶向和杀伤能力。

· CAR T细胞治疗面临的挑战及相应策略

       根据抗HIV的CAR T细胞在体外的表现，该疗法在体内应该是有效的。然而，早期的临床试验显示，CAR T细胞疗法是安全的，但在体内的疗效甚微。此外，该治疗方法的临床转化还存在一些挑战和限制：

· 细胞扩增

       研究人员发现将修饰后的或者天然的HIV特异性的CTL输入到患者体内，这些细胞在很短的时间就会因发生免疫反应或细胞凋亡而死亡。而CAR T细胞回输体内也同样存在这种现象，这是研究者在将其运用到临床治疗时首要解决的问题。Sockolosky等人利用白细胞介素-2（IL-2），一种效应T细胞扩增、生存和发挥功能所需的细胞因子，来帮助CAR T细胞扩增。此后，研究人员还发现同时使用细胞因子IL-7和IL-15来培养CD19 CAR T细胞，能够促进naive和记忆细胞的产生和增殖。因此，与单独在IL-2中培养的CD19 CART 细胞相比，同时使用IL-7和IL-15在体内有更好的持久性和抗肿瘤疗效。另外，Fraietta等人用敲除甲基胞嘧啶二氧酶TET2 基因来改善CAR T细胞的扩增和疗效。他们观察到，在一个受试者中，94%的CAR T细胞中的TET2基因由于CAR基因的整合而破坏，推测这些细胞可能来源于同一细胞。还有一种在体内提高CAR T细胞功能和持久性的方法是阻断免疫检查点分子。通过CRISPR、shRNA或PD-1抗体阻断PD-1的策略已在癌症特异性CAR中实施，并观察到了良好的抗肿瘤效果。虽然PD-1阻断在HIV感染中能增强T细胞反应和抑制病毒血症，但内源性阻断PD-1或其他免疫检查点分子是否会促进体内的HIV特异性CAR T细胞反应还有待观察。

· 对HIV的易感性

         另一个挑战是CD4 CAR修饰的CD8+T细胞容易受到HIV感染，因为CD8+T细胞的细胞表面有丰富的CCR5共受体。为此，Kamata等人同时在细胞中表达两个shRNA，一个针对CCR5的表达，另一个针对HIV的LTR，以防止基于CD4受体的CAR T细胞感染HIV。他们的结果显示，随着时间的推移，表达shRNA的基于CD4受体的CAR T细胞的数量比没有表达shRNA的要高，这表明CAR CD8+T细胞对HIV感染的易感性可能是其存在短暂的部分原因。Liu等人通过添加17b人类单克隆抗体的单链可变片段，构建了一种新型的双特异性CD4-CAR，它可以识别gp120上高度保守的抗原表位。这种CD4-17b CAR显示出对HIV感染的抵抗力，比基于CD4受体的CAR具有更高的病毒抑制效力。

· 脱靶效应

       CAR可以被构建成专门针对HIV潜伏感染的细胞，以实现病毒的清除。然而，CAR也有可能攻击其他表达相同或类似目标抗原的健康细胞，这被称为脱靶效应。例如，由于CD19在正常和恶性B细胞上都有表达，使用基于CD19的CAR T细胞疗法治疗血液系统恶性肿瘤时，B细胞萎缩是不可避免的。幸运的是，没有数据表示在CD4-CAR试验中表达MHC II（CD4对应物）的细胞系会发生细胞溶解。因此，利用基于bNAb的CAR T疗法更加安全，因为这些bNAbs是专门针对HIV 包膜糖蛋白，而CD4在自然界可能有更多的同源物。然而，CAR在没有MHC I协助的情况下识别其特定抗原的能力引起了另一个问题，即它可能会识别可溶性抗原（如无细胞的或毒粒相关的HIV蛋白）并被激活然后释放细胞因子，对周围组织产生毒性，而不是专门针对被HIV感染的细胞。

· 严重的细胞因子释放综合征（sCRS）

       当CAR T细胞被注入到患者体内时，它们将通过与其特定抗原的相互作用而被激活。虽然它们可以特异性地攻击表达目标抗原的细胞，但也可能导致一个渐进的全身性炎症过程，即所谓的严重细胞因子释放综合征（sCRS）。其典型症状是高烧、低血压，甚至是器官衰竭。在输注CAR T细胞后，CRS通常在1-14天内发生，并持续2-3周的时间。IL-6是CRS的一个标志性细胞因子。CAR T细胞介导的癌症清除可能引发IL-6水平的升高。CRS期间IL-6的最重要来源是人类单核细胞。因此，屏蔽单核细胞或用tocilizumab阻断IL-6受体可以预防CRS。据报道，tocilizumab能迅速逆转CAR T疗法在一个重症儿童中诱发的sCRS。皮质类固醇在某些情况下也有助于控制CRS。然而，与tocilizumab相比，大剂量的皮质类固醇可能会影响CAR T细胞的抗肿瘤效果。

       总而言之，HIV的CAR T细胞疗法(特别是基于bNAb的CAR T)是治疗HIV感染的很有前景的方法之一，虽然目前面临着许多挑战，但值得科研人员进一步探索。

参考资料：

https://www.cdc.gov/hiv/basics/whatishiv.html

https://www.drugtargetreview.com/news/69860/novel-car-t-cell-therapy-could-help-cure-hiv/

Mu W, Carrillo MA, Kitchen SG. Engineering CAR T Cells to Target the HIV Reservoir. Front Cell Infect Microbiol. 2020 Aug 13;10:410. doi: 10.3389/fcimb.2020.00410. PMID: 32903563; PMCID: PMC7438537.

Qi J, Ding C, Jiang X, Gao Y. Advances in Developing CAR T-Cell Therapy for HIV Cure. Front Immunol. 2020 Mar 10;11:361. doi: 10.3389/fimmu.2020.00361. PMID: 32210965; PMCID: PMC7076163.

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